代谢组和转录组联合分析揭示红枣的叶芽与成熟叶片代谢产物的生物合成特征
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单位：洛阳师范学院生命科学学院
红枣叶以其较高的营养价值和药用价值而闻名。目前国内外对红枣叶中生物活性成分的研究主要集中在红枣叶中生物活性成分的鉴定上；以往研究所用的红枣叶片均为单一发育阶段采集，检测到的化合物种类和数目有限，因此缺乏对不同发育阶段红枣叶片代谢产物的全面、动态研究。
根据红枣果实和叶片的颜色格局，品种可分为两类：I型包括大多数品种，其特征是果实颜色由绿色到黄色再到红色，叶片颜色由浅绿色到深绿色；II型包括少数观赏品种，其果实由紫色变为黄色再变为红色，叶色由紫色变为墨绿色。目前，对红枣果实颜色的研究多集中在色素成分和遗传基础上，而对其叶片颜色的研究较少。
组学植物材料：‘三变红’和‘胎里红’的叶芽（分别命名为LS1和LT1）和成熟叶（分别命名为LS2和LT2）(图1)。
三变红(LS)vs胎里红(LT)
研究思路：
1.枣叶代谢组：代谢物鉴定及类别数量统计
为了更好地了解叶色变化过程中相关代谢物的动态变化，通过UPLC-MS/MS分析对两个紫叶枣品种的叶片进行代谢物鉴定。经过代谢组的样本聚类和相关性分析，4组间区分明显(图2A)，组内样本呈显著相关；PCA也表现出LS1、LS2、LT1和LT2之间的明显分离(图2B)。
如图2C，代谢组确定了种代谢物,可以分为超过18个不同的类别，黄酮是主要代谢产物(23.14%)，可分为79种黄酮，40种黄酮醇，17种黄烷酮，12种花青素，7种异黄酮，3种原花青素和其他22种黄酮类化合物。其中，从LS1、LS2、LT1和LT2中分别检测到、、和个代谢物(图2D)，表明叶芽和成熟叶具有不同的代谢产物谱。
图2.(A)代谢物聚类热图;(B)叶芽和成熟叶的主成分分析;(C)红枣叶代谢物成分分析;(D)组间代谢产物数量的维恩图。
2.枣叶代谢组：叶芽与成熟叶片之间的代谢组变化
LS1与LS2之间共检测到个差异代谢物，其中LS1中上调代谢产物个，下调代谢产物个(图3A);在LT1和LT2之间鉴定的个差异代谢物中，有个和个代谢物在LT1中分别上调和下调(图3B)。
表1显示了不同样本中的差异代谢物及类别，多重比较分析显示，两个品种中不同发育时期间检测到超过一半的差异代谢物(种代谢物)共有(图3C)。
差异代谢物也可以大致分为两类：第一类为抗氧化成分，包括黄酮类、生物碱类、萜烯类、维生素及其衍生物、酚胺类、多酚类和甾类化合物，大部分抗氧化成分在叶芽中的浓度高于成熟叶；第二类是味觉成分，包括有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和碳水化合物，氨基酸及其衍生物和碳水化合物的大部分在叶芽中显著高于成熟叶。
表1：差异积累代谢物统计
图3.(A)LS2与LS1(B)LT2与LT1的差异代谢物聚类热图；(C)LS2vsLS1、LT2vsLT1的差异代谢物维恩图。
综上所述，两个紫叶枣品种表现出相似的代谢物积累模式。在枣叶发育过程中，约有40%的代谢物存在显著差异，其中黄酮类化合物为主要差异代谢物。
3.色素含量分析：叶色变化背后的色素积累
以紫色叶品种和绿色叶品种为研究对象，测定了叶片色素的含量，以阐明色素生物合成对叶片颜色变化的影响机制。紫叶和绿叶品种的叶绿素和类胡萝卜素含量表现出相似的积累规律，即随着叶片发育含量急剧增加(图4A-B)；紫色叶品种叶片的花青素含量在成熟过程中显著下降。相反，绿叶品种中叶片花青素含量显著增加(图4C)。因此表明，叶片颜色的变化主要是由花青素决定的。
为了进一步检测花青素的类型，将花青素与代谢产物数据库进行比较。其中花青素O-丁香酸和芹菜素氯化物在叶芽中含量较高，其他花青素在叶片发育过程中保持稳定水平(图4D)。LT品种（紫叶）叶片中的芹菜素氯化物、花青素和花青素O-丁香酸随着成熟过程而减少；相反，飞燕草素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素、芍药素和矮牵牛素3-O-葡萄糖苷这4种花青素随着叶片发育而增加(图4D)。多重比较表明，花青素O-丁香酸和芹菜素氯化物在两个紫色叶片品种的叶芽着色中起着关键作用(图4E)。
图4.紫色叶芽和绿色成熟叶的色素分析:(A)总叶绿素含量;(B)类胡萝卜素总含量;(C)总花青素含量;(D)被定量鉴定的花青素的热图。(E)维恩图显示LS2vsLS1、LT2vsLT1花青素差异积累的数量。
4.RNA-Seq分析：类黄酮结构和调控基因的差异表达
为研究叶芽与成熟叶之间的基因表达谱，以LS1、LS2、LT1和LT2为材料进行mRNA测序分析。与LS2相比：LS1中上调基因个，下调基因个；与LT2相比，LT1中上调基因个，下调基因个。
基于代谢组学分析结果，黄酮类化合物是枣叶的主要代谢产物，并测定了枣叶的着色，因此转录组分析也专注于类黄酮的生物合成。LS1和LS2之间存在20个类黄酮结构基因差异表达，且所有基因均随着叶片发育而下调(图5)；同样，LT1和LT2比较结果也显示出19个类黄酮结构基因在成熟过程中表达量大幅下降(图5)；且大部分差异表达的类黄酮结构基因在两个品种中重叠。
R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白在调节类黄酮生物合成中发挥重要作用。LS1与LS2共检测到个类黄酮调控基因差异表达，在LS1中上调的基因有95个，其中R2R3-MYB基因52个，bHLH基因25个，WD40基因18个；LS1中下调的基因有75个，其中R2R3-MYB基因49个，bHLH基因12个，WD40基因14个。在LT1和LT2之间检测到37个类黄酮调控基因差异表达：在LT1中27个基因上调，其中R2R3-MYB基因6个，bHLH基因21个，WD40基因4个;而只有2个R2R3-MYB基因、3个bHLH基因和1个WD40基因下调。有27个上调基因和5个下调基因在两个品种间重叠，其中R2R3-MYB基因7个，bHLH基因21个，WD40基因4个。
为了验证转录组分析结果的准确性和重复性，随机选取10个类黄酮结构基因和5个类黄酮调控基因进行qRT-PCR验证。对于所有15个基因，qRT-PCR分析显示了与RNA-Seq数据相同的表达趋势。
图5.枣叶类黄酮生物合成途径
5.不同光照处理实验：验证光照对叶芽中类黄酮积累的影响
光照是影响类黄酮积累的重要因素。为研究光照对红枣叶片中黄酮类化合物积累的影响，以LS和LT的叶芽为试验材料，分别在光照和黑暗条件下生长。黑暗条件下的叶芽呈绿色(图6A);与光处理下的叶芽相比，总类黄酮和总花青素的含量大大减少(图6B和C)。进一步通过qRT-PCR研究了主要的类黄酮结构基因的表达水平，发现相比光照处理的叶芽，黑暗处理叶芽中这些基因的大多数显著下调。综上所述，红枣叶片中黄酮类化合物呈光依赖性积累。
图6.暗处理(LS1-D和LT1-D)和光处理(LS1-L和LT1-L)条件下叶芽中黄酮类化合物的积累：(A)叶芽的表型。(B)总黄酮含量。(C)总花青素含量。
研究目的：揭示红枣叶片中代谢物的全面动态变化及颜色变化机理。
研究结果：本研究从红枣叶中鉴定出个初生和次生代谢物。叶芽与成熟叶之间约有40%的代谢物差异显著，主要分为抗氧化成分和口感两大类。黄酮类化合物是主要的差异代谢物，花青素决定了叶片的颜色，并以依赖光的方式积累。这些结果进一步加深了对红枣叶片黄酮类化合物合成代谢产物积累和分子机制的认识，也提高了对红枣叶化学成分和药用价值的认识，为红枣叶作为功能性食品的开发提供了理论支持。
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